Sangersekvensering

Kurs: MDBI

Typ	Molekylär metod (DNA-sekvensering)
Nyckelfynd	Kedjeterminering med ddNTP — referensmetod för enskild sekvens

Vad är det?

• Klassisk DNA-sekvenseringsmetod (Frederick Sanger) som bestämmer basordningen i en DNA-sträng.
• Länge referensmetod (“gold standard”) för sekvensering av enskilda gener/regioner.

Princip / Utförande

• Amplifiering följt av sekvensreaktion med normala dNTP + fluorescensmärkta dideoxinukleotider (ddNTP).
• ddNTP saknar 3’-OH → kedjan avbryts slumpvis vid varje bas → fragment av olika längd separeras med Kapillärelektrofores och avläses som en sekvenskurva.

Indikation / Användning

• Verifiering av enskilda mutationer och varianter i molekylär patologi.
• Konfirmation av fynd från NGS; utredning av ärftliga syndrom (enstaka gen).

Tolkning / Fallgropar

• Relativt låg känslighet för låggradig mosaik/liten tumörcellsandel (kräver oftast en betydande andel muterade alleler).
• Ineffektiv för många gener samtidigt — där används i stället NGS.

Tenta-fokus

Sangersekvensering bygger på kedjeterminering med ddNTP. Referensmetod för enskild sekvens, men lägre känslighet och kapacitet än NGS.

Klinisk pärla

I dagens diagnostik screenar man brett med NGS och konfirmerar viktiga fynd med Sanger — metoderna kompletterar varandra.

Kopplingar

• DNA-sekvensering — övergripande metodfamilj
• Massiv parallellsekvensering — modern högkapacitetsmetod
• Mutation — det som detekteras
• Molekylärpatologi — tillämpningsområdet
• PCR — föregående amplifieringssteg