Sekvensering

Kurs: MDBI

Typ	Molekylär metod — bestämmer nukleotidordningen i DNA/RNA
Huvudtyper	Sangersekvensering (kapillär) och NGS
Användning	Påvisa mutationer, gen-paneler, MRD
Mått	Variantallelfrekvens (VAF)

Vad är det?

• Sekvensering bestämmer den exakta ordningsföljden av nukleotider i DNA eller RNA.
• I hematopatologisk diagnostik används den för att identifiera mutationer med diagnostisk, prognostisk och behandlingsstyrande betydelse.

Princip och utförande

• Sangersekvensering (dideoxy-/kedjeterminering): Kapillärelektrofores av fluorescensmärkta terminatorer; känslighet ned till ca 15–20% muterad allel — lämplig för enstaka loci.
• Next-generation sequencing (NGS): miljontals fragment sekvenseras parallellt; medger gen-paneler, helexom- och genomsekvensering samt hög känslighet vid djup täckning.
• Steg: Nukleinsyraextraktion → Bibliotekspreparation → sekvensering → bioinformatisk analys mot referensgenom.

Indikation och användning

• Påvisa drivarmutationer: JAK2, CALR, MPL (MPN); NPM1, FLT3 (AML).
• Myeloida gen-paneler vid MDS/AML och Klonalitetsanalys.
• Monitorering av Minimal restsjukdom och val av targeterad terapi.

Tolkning och fallgropar

• Variantallelfrekvens (VAF): andel muterade läsningar — påverkas av tumörcellsandel och zygoti.
• Känslighetsgräns: Sangersekvensering missar små kloner som NGS fångar.
• Variant av oklar signifikans (VUS): kräver tolkning mot databaser och klinik.
• Risk för artefakter, för åldersrelaterad klonal hematopoes (CHIP) som bifynd och för täckningsberoende falskt negativa.

Tenta-fokus

Kunna skilja Sangersekvensering (en/få gener, lägre känslighet ca 15–20%) från NGS (parallell, hög känslighet, gen-paneler). VAF är nyckelmåttet för mutationsbörda och MRD.

Klinisk pärla

En låg VAF behöver inte betyda liten tumör — det kan vara klonal hematopoes (CHIP) hos en äldre patient. Tolka alltid molekylärfyndet i klinisk kontext.

Kopplingar

• Sangersekvensering — klassisk enkelgenmetod
• Massivt parallell sekvensering — NGS, parallell sekvensering
• NPM1 — exempel på mutation som påvisas
• Variantallelfrekvens — kvantitativt mått på mutationsbörda
• Minimal restsjukdom — sekvensering för monitorering