Affinitetskromatografi

Kurs: MDBI Del: 03 Klinisk Kemi Avsnitt: 11 Diabetes, Lipidrubbningar och Hjärtmarkörer

Vad är det?

Affinitetskromatografi är en separationsmetod där analyten binds selektivt till en ligand som är kopplad till en fast fas. Vid analys av HbA1c används boronsyrabaserade affinitetsmetoder, som mäter totala glykerade Hb-fraktioner.

Mekanism

• Provet (hemolysat av erytrocyter) förs över en kolonn där boronsyra är immobiliserad.
• Boronsyran bildar en reversibel komplexbindning med cis-diolgrupperna i de glukosrester som är bundna till Hemoglobin.
• Icke-glykerat hemoglobin passerar kolonnen fritt medan den glykerade fraktionen kvarhålls och därefter elueras med en konkurrerande sockerbuffert (t.ex. sorbitol).
• Andelen glykerat hemoglobin beräknas ur absorbansen i de två fraktionerna.
• Till skillnad från Jonbyteskromatografi och Isoelektrisk fokusering, som utnyttjar den laddningsförändring glykeringen medför, separerar affinitetsmetoden på strukturell bindning.

Klinisk relevans & Diagnostik

• Utgör ett alternativ till HPLC och till immunkemiska HbA1c-metoder.
• Fördel: metoden störs mindre av hemoglobinvarianter som HbA2, HbF och HbS, vilka förskjuter topparna i laddningsbaserade system.
• Nackdel: resultatet speglar den totala glykeringen och är inte HbA1c-specifikt, varför noggrann kalibrering krävs för att resultatet ska kunna rapporteras i mmol/mol.
• Alla HbA1c-metoder förutsätter normal erytrocytöverlevnad — vid Hemolys ses falskt låga värden.

Kopplingar

Relaterat: HbA1c, Jonbyteskromatografi, HPLC, Isoelektrisk fokusering, Immunkemi, Hemoglobin