HPLC

Kurs: MDBI Del: 03 Klinisk Kemi Avsnitt: 11 Diabetes, Lipidrubbningar och Hjärtmarkörer

Vad är det?

HPLC står för high performance liquid chromatography, högtrycksvätskekromatografi. Inom klinisk kemi är den vanligaste tillämpningen bestämning av HbA1c, där hemoglobinfraktionerna separeras på en jonbytarkolonn under högt tryck.

Mekanism

• Glykeringen av en fri aminogrupp i HbA ger en laddningsförändring, vilket är den fysikaliska egenskap metoden utnyttjar — samma princip som vid Jonbyteskromatografi och Isoelektrisk fokusering.
• Utförande: ett hemolysat av erytrocyter appliceras på en katjonbytare i det högtrycksvätskekromatografiska systemet.
• De olika Hb-fraktionerna, inklusive HbA1c, elueras därefter med buffert av ökande jonstyrka eller minskande pH.
• HbA1c beräknas som ytan under HbA1c-toppen i kromatogrammet, uttryckt i procent av den totala ytan (= totala Hb-mängden).
• Alternativa metodprinciper är affinitetskromatografiska metoder (mäter totala glykerade Hb-fraktioner) och immunkemiska metoder.

Klinisk relevans & Diagnostik

• HbA1c ≥ 48 mmol/mol är ett av diagnoskriterierna för Diabetes mellitus (kräver konfirmerande prov vid ytterligare ett tillfälle).
• Fördelen med HPLC är att hela kromatogrammet blir synligt: avvikande toppar avslöjar hemoglobinopatier och förhöjt HbA2, som annars kan ge falska HbA1c-värden.
• Detta är kliniskt viktigt eftersom onormala Hb-varianter är en känd orsak till falskt låga HbA1c-värden, liksom förkortad erytrocytöverlevnad vid Hemolys, stor Blödning och efter Blodtransfusion.
• Metoden förutsätter normal erytrocytöverlevnad (ca 120 dagar) för korrekt tolkning.

Kopplingar

Relaterat: HbA1c, Jonbyteskromatografi, Isoelektrisk fokusering, Affinitetskromatografi, Hemoglobinopati, Hemoglobin, HbA2