Isoelektrisk fokusering

Kurs: MDBI Del: 03 Klinisk Kemi Avsnitt: 11 Diabetes, Lipidrubbningar och Hjärtmarkörer

Vad är det?

Elektroforetisk separationsteknik där proteiner vandrar i en pH-gradient tills de når sin isoelektriska punkt (pI) och där stannar. Metoden har mycket hög upplösning och används bland annat för bestämning av HbA1c och för att karakterisera hemoglobinvarianter.

Mekanism

• Ett protein bär nettoladdning som beror på pH: positiv vid pH under pI, negativ vid pH över pI.
• I ett elektriskt fält i en stabil pH-gradient vandrar proteinet mot den elektrod som motsvarar dess laddning, tills nettoladdningen blir noll vid pI — där fokuseras det till ett skarpt band.
• Vid HbA1c-bestämning utnyttjas att glykeringen av en fri aminogrupp i HbA ger en laddningsförändring: den N-terminala aminosyran i beta-kedjan reagerar med Glukos via en labil Schiffbas som irreversibelt omlagras till ketoamin.
• Laddningsskillnaden gör att HbA1c får något annorlunda pI än HbA och kan separeras — samma grundprincip utnyttjas i Jonbyteskromatografi och HPLC.
• Alternativa metodprinciper är affinitetskromatografi (mäter totala glykerade Hb-fraktioner) och immunkemiska metoder, som i stället utnyttjar strukturell igenkänning.

Klinisk relevans & Diagnostik

• HbA1c speglar glukosnivån under de senaste månaderna, tidsviktat: senaste 30 dagarna 50 %, 30–90 dagar 40 %, 90–120 dagar 10 %.
• Diagnosgräns HbA1c ≥ 48 mmol/mol, med krav på konfirmerande prov.
• Laddningsbaserade metoder är känsliga för andra Hb-varianter: högt HbA2 och hemoglobinopatier kan ge falska värden, liksom förkortad erytrocytöverlevnad vid Hemolys eller efter Blodtransfusion.
• Isoelektrisk fokusering används därför även diagnostiskt för att identifiera avvikande hemoglobinfraktioner.

Kopplingar

Relaterat: HbA1c, Jonbyteskromatografi, HPLC, Elektrofores, Hemoglobinopati, HbA2, Affinitetskromatografi