Fluorescensmikroskop
Kurs: MDBI
| Typ | Optiskt instrument för fluorescens-baserad mikroskopi |
| Princip | Excitationsljus + filter isolerar den emitterade fluorescensen |
| Nyckelkomponent | Dikroisk spegel mellan excitations- och emissionsfilter |
| Används vid | Immunfluorescens och FISH |
Vad är det?
- Ett fluorescensmikroskop är ett mikroskop byggt för att belysa ett preparat med ljus av en excitationsvåglängd och bara släppa fram det längre fluorescerande ljus som fluoroforerna sänder ut.
- Det gör svag, specifik signal synlig mot en mörk bakgrund, vilket är grunden för immunfluorescens och FISH.
- Utnyttjar Stokes-skiftet — att emissionen har längre våglängd än excitationen — för att optiskt skilja signal från excitationsljus.
Princip och komponenter
- Kraftig ljuskälla (kvicksilver-, LED- eller laserkälla) ger excitationsljus.
- Excitationsfilter släpper bara igenom rätt excitationsvåglängd.
- Dikroisk spegel reflekterar excitationsljuset mot preparatet men släpper igenom den längre emissionsvåglängden.
- Emissionsfilter blockerar kvarvarande excitationsljus så att endast fluorescensen når ögat/kameran.
- Ofta i epifluorescens-uppställning (excitation och detektion genom samma objektiv).
Användning
- Immunfluorescens på njur- och hudbiopsier vid autoimmuna/glomerulära sjukdomar.
- FISH för gen- och kromosomavvikelser i cytologiskt och histologiskt material.
- Avläsning av fluorescensmärkta antikroppar och prober.
Tolkning och fallgropar
- Fotoblekning: fluorescensen mattas vid långvarig belysning — arbeta snabbt och förvara mörkt.
- Autofluorescens i vävnad kan ge falsk bakgrund.
- Fel filteruppsättning för aktuell fluorofor ger svag eller utebliven signal.
Tenta-fokus
Kunna de tre optiska nyckeldelarna: excitationsfilter → dikroisk spegel → emissionsfilter. De utnyttjar Stokes-skiftet för att visa svag emission mot mörk bakgrund.
Klinisk pärla
Immunfluorescens på njurbiopsi läses av direkt och relativt snabbt eftersom signalen bleks — och preparaten är mindre hållbara än DAB-färgade ljusmikroskopisnitt.
Kopplingar
- Fluorescens — fenomenet instrumentet bygger på
- Immunfluorescens — vanligaste diagnostiska tillämpningen
- FISH — molekylär tillämpning
- Dikroisk spegel — central optisk komponent
- DAB — motsvarande detektion i ljusmikroskopisk IHC