Autofluorescens

Kurs: Basvetenskap 6

Vad är det?

• Egenskapen hos vissa biologiska molekyler att sända ut ljus av längre våglängd när de belyses med excitationsljus, utan att någon fluorescerande färgning tillsatts.
• Kallas även primär fluorescens, till skillnad från sekundär fluorescens som fås med tillsatta fluoroforer som FITC, DAPI eller auramin.
• Kan vara både ett diagnostiskt verktyg och en störande bakgrund i fluorescensmikroskopi.

Princip

• Molekyler med konjugerade dubbelbindningar och aromatiska ringsystem absorberar fotoner, exciteras till högre energinivå och emitterar ljus vid återgång till grundtillstånd.
• Skillnaden mellan excitations- och emissionsvåglängd kallas Stokes shift.
• Vanliga endogena fluoroforer: NADH, FAD, kollagen, elastin, lipofuscin, porfyriner, keratin, tryptofan och klorofyll.

Diagnostisk användning

• Woodslampa (UV-ljus 365 nm) i dermatologi: Malassezia furfur vid pityriasis versicolor ger gulaktig fluorescens; Corynebacterium minutissimum vid erytrasma ger korallröd fluorescens från koproporfyrin III; vissa dermatofyter vid tinea capitis ger grönaktig fluorescens.
• Pseudomonas aeruginosa producerar pyoverdin som ger grönaktig fluorescens i UV-ljus — hjälper vid brännskadeinfektioner.
• Porfyrier — erytropoetisk protoporfyri ger rödfluorescerande erytrocyter.
• Cystoskopi med fluorescensdiagnostik (hexaminolevulinat) förbättrar detektion av blåscancer.
• Autofluorescensavbildning av fundus används för att bedöma lipofuscin i retinalt pigmentepitel vid makuladegeneration.

Fallgropar i mikroskopi

• Elastin och kollagen i vävnadssnitt ger kraftig grön bakgrundsfluorescens som kan misstolkas som positivt fynd vid immunfluorescens.
• Lipofuscin ackumuleras i neuron, kardiomyocyter och hepatocyter med åldern och fluorescerar brett över alla kanaler — svårt att filtrera bort.
• Formalinfixering och glutaraldehyd ökar autofluorescens.
• Motåtgärder: välja fluoroforer med emission i rött eller nära infrarött, spektral avbildning med linjär unmixing, behandling med Sudan Black B eller natriumborohydrid.
• Vid auraminfärgning av Mycobacterium tuberculosis måste bakgrundsautofluorescens från vävnad skiljas från de verkliga syrafasta stavarna.

Klinisk pärla

Woodslampan är billig, snabb och sängkantsnära. Korallröd fluorescens i ljumsken talar för erytrasma (behandlas med erytromycin eller azoler) och inte för tinea cruris — två diagnoser som ser nästan identiska ut i vanligt ljus.

Tenta-fokus

Kunna koppla fluorescensfärg till agens: korallröd = Corynebacterium minutissimum (erytrasma), gul-guldaktig = Malassezia (pityriasis versicolor), grönaktig = Pseudomonas aeruginosa (pyoverdin) och vissa dermatofyter.

Kopplingar

• Woodslampa — det kliniska instrument som utnyttjar fenomenet
• Fluorescensmikroskopi — metod där autofluorescens både används och stör
• Lipofuscin — endogent pigment med kraftig autofluorescens
• Pseudomonas aeruginosa — bakterie med fluorescerande pigment
• Immunfluorescens — metod där autofluorescens är en klassisk felkälla
• Porfyrin — molekylklass bakom röd fluorescens