Sekundär antikropp
Kurs: MDBI
| Typ | Detektionsantikropp i Immunhistokemi/Immunfluorescens |
| Bindning | Binder den primära antikroppen (art-specifikt) |
| Bär | Enzym (HRP), Fluorokrom eller Biotin för signal |
| Syfte | Detektera och förstärka signalen (indirekt metod) |
Vad är det?
- En sekundär antikropp är en märkt Antikropp som riktar sig mot den primära antikroppen i stället för mot antigenet direkt.
- Den bär detektionsmolekylen — ett enzym (HRP, Alkaliskt fosfatas), ett Fluorokrom eller Biotin — och gör antigen–antikroppsreaktionen synlig i Immunhistokemi (IHC) och Immunfluorescens (IF).
Princip och utförande
- Indirekt metod: (1) Primär antikropp binder Antigen; (2) sekundär (anti-species) antikropp binder den primära; (3) kopplat enzym omvandlar Kromogen (DAB) till en färgutfällning, eller så exciteras ett Fluorokrom.
- Signalförstärkning: flera sekundärantikroppar binder per primär; ytterligare amplifiering via (strept)avidin–biotin eller polymer-/Tyramidamplifiering.
- Sekundärantikroppen måste vara riktad mot den art som den primära kommer från (t.ex. anti-mus, anti-kanin).
Indikation och användning
- Immunhistokemi och Immunfluorescens på vävnad och Cellblock.
- Western blot, ELISA och Flödescytometri (indirekt märkning).
- Möjliggör användning av omärkta primärantikroppar med kraftig signalförstärkning.
Tolkning och fallgropar
- Bakgrund/ospecifik infärgning: korsreaktivitet eller otillräcklig blockering.
- Fel art: sekundär måste matcha primärens värddjur.
- Endogent Biotin (t.ex. i lever, njure) ger falsk positivitet i biotinbaserade system.
- Endogen Peroxidas (t.ex. i Granulocyter, Erytrocyter) måste blockeras.
- Använd alltid positiva och negativa kontroller.
Tenta-fokus
Förstå skillnaden: Primär antikropp binder antigenet och ger specificiteten, medan den sekundära antikroppen binder den primära samt bär detektionen och förstärker. Indirekt metod = bättre känslighet men risk för bakgrund.
Klinisk pärla
Oväntad diffus infärgning i lever/njurvävnad? Misstänk endogent Biotin om ett avidin–biotin-system använts — byt till polymerbaserad detektion.
Kopplingar
- Primär antikropp — det sekundärantikroppen binder
- Immunhistokemi — huvudanvändningen
- DAB — kromogen som ger brun färgutfällning
- Fluorokrom — märkning vid immunfluorescens
- Antikropp — grundstrukturen