Western blot
Kurs: Basvetenskap 6
| Typ | Immunokemisk metod för att detektera specifikt protein |
| Steg | SDS-PAGE → överföring till membran → antikroppsdetektion |
| Detekterar | Protein av given storlek, semikvantitativt |
| Klinisk användning | Konfirmationstest (HIV historiskt, Borrelia, HTLV) |
| Vanlig fallgrop | Kräver rätt laddningskontroll (Beta-aktin, GAPDH) |
Vad är det?
- Western blot (immunoblot) separerar proteiner efter molekylvikt och identifierar ett specifikt protein med hjälp av antikroppar.
- Namnet är ett skämt: Southern blot (DNA) uppkallades efter Edwin Southern, varpå Northern blot (RNA) och Western blot (protein) följde geografiskt.
Princip
- Proteiner denatureras med SDS och betamerkaptoetanol; SDS ger en negativ laddning proportionell mot proteinets massa så att migrationen i gelen enbart beror på storlek.
- Efter SDS-PAGE överförs proteinerna elektroforetiskt till ett Nitrocellulosa- eller PVDF-membran.
- Membranet blockeras (mjölkpulver eller BSA) för att förhindra ospecifik bindning.
- Primär antikropp binder målproteinet; sekundär antikropp kopplad till pepparrotsperoxidas binder den primära och ger kemiluminescens som fångas på film eller digital kamera.
Utförande i steg
| Steg | Nyckelpunkt |
|---|---|
| Lysering | Proteashämmare och fosfatashämmare måste tillsättas |
| Proteinkvantifiering | Bradford eller BCA — lika mycket protein per brunn |
| Elektrofores | Gelprocent väljs efter målproteinets storlek |
| Transfer | Våt eller semidry; kontrolleras med Ponceau S-färgning |
| Blockering | 1 h i 5 % mjölk (ej vid fosfoproteiner — använd BSA) |
| Antikroppar | Primär över natt +4 °C, sekundär 1 h rumstemperatur |
| Detektion | ECL; band jämförs mot molekylviktsmarkör |
Tolkning
- Bandets position anger molekylvikt, bandets intensitet anger relativ mängd.
- Normaliseras alltid mot en laddningskontroll (Beta-aktin, GAPDH, tubulin) eller total proteinfärgning.
- Metoden är semikvantitativ — signalen mättas lätt och förhållandet till proteinmängd är inte linjärt över hela intervallet.
- Kliniskt (t.ex. Borreliaserologi) tolkas ett bandmönster: ett visst antal specifika band (VlsE, OspC, p41, p39) krävs för positivt svar.
Klinisk användning
- Borrelia: immunoblot som konfirmation efter positiv/gränsvärdig ELISA — tvåstegsalgoritm.
- HIV: historiskt konfirmationstest; ersatt av fjärde generationens antigen/antikropps-test plus HIV-RNA och differentierande immunoassay.
- HTLV-1, Syfilis-linjeblot, autoimmuna myositantikroppar, Muskeldystrofi-diagnostik (dystrofinuttryck).
- Forskningsmässigt: verifiering av Knockout/knockdown, fosforyleringsstatus i signalvägar.
Fallgropar
- Ospecifika band pga otillräcklig blockering eller för hög antikroppskoncentration.
- “Smilande” band vid för hög spänning/värmeutveckling.
- Ofullständig transfer av stora proteiner (>150 kDa).
- Överexponering ger mättad signal → falskt intryck av oförändrad nivå.
- Antikroppen måste vara validerad — en icke-validerad antikropp är den vanligaste orsaken till irreproducerbara resultat.
Klinisk pärla
Vid Borreliaserologi är immunoblot ett konfirmationstest, inte ett screeningtest. Att beställa blot direkt på låg klinisk misstanke ger många falskt positiva IgM-band och feltolkade “kroniska borrelia”-diagnoser. Följ alltid tvåstegsalgoritmen.
Tenta-fokus
Kom ihåg blot-familjen: Southern = DNA, Northern = RNA, Western = protein, och Eastern/Far-Western för posttranslationella modifieringar respektive protein-proteininteraktioner. SDS gör att migrationen beror enbart på storlek, inte på laddning eller form.
Kopplingar
- SDS-PAGE — separationssteget
- ELISA — snabbare, kvantitativ men saknar storleksinformation
- Southern blot — DNA-motsvarigheten
- Borreliaserologi — vanligaste kliniska tillämpningen