RT-PCR
Kurs: Basvetenskap 6
| Typ | Molekylärbiologisk nukleinsyraamplifiering |
| Princip | Revers transkriptas gör cDNA av RNA → PCR amplifierar |
| Används för | RNA-virus (SARS-CoV-2, Influensavirus, HIV, Hepatit C-virus), genuttryck |
| Svarstid | 1–4 timmar (snabbtest ca 20 min) |
| Sensitivitet | Mycket hög — detekterar ned till 10–100 kopior/mL |
Vad är det?
- Revers transkriptas-PCR — en tvåstegsmetod där RNA först skrivs om till komplementärt DNA (cDNA) med enzymet revers transkriptas, varefter cDNA:t amplifieras med vanlig PCR.
- Nödvändig eftersom DNA-polymeraset i PCR inte kan använda RNA som mall.
- Kombineras nästan alltid med realtidsdetektion (qRT-PCR) där fluorescens mäts under varje cykel — ger både påvisande och kvantifiering.
Princip och utförande
- Steg 1 — revers transkription: RNA + primer (random hexamerer, oligo-dT eller genspecifik primer) + revers transkriptas (från retrovirus, t.ex. MMLV eller AMV) vid 42–55 °C → cDNA.
- Steg 2 — amplifiering: Taq-polymeras, dNTP, Mg²⁺ och två genspecifika primrar. Cykling: denaturering 95 °C → primerbindning 55–60 °C → elongering 72 °C. 35–45 cykler.
- Detektion: hydrolysprob (TaqMan) med fluorofor och quencher, eller interkalerande färg (SYBR Green).
- Ct-värde (cycle threshold) = antal cykler tills signalen passerar tröskeln. Lågt Ct = hög virusmängd. Varje 3,3 cykler motsvarar ungefär en tiopotens.
- En-stegs-RT-PCR (allt i samma rör) minskar kontaminationsrisk; två-stegs ger mer flexibilitet och möjlighet att spara cDNA.
Tolkning
| Ct-värde | Ungefärlig tolkning |
|---|---|
| < 20 | Mycket hög virusmängd, hög smittsamhet |
| 20–30 | Måttlig till hög virusmängd |
| 30–37 | Låg virusmängd, sen infektion eller tidig fas |
| > 37 / ingen kurva | Negativt eller under detektionsgräns |
- Interna kontroller är obligatoriska: extraktionskontroll och humant husållningsgen (t.ex. RNase P) som visar att provet innehåller cellmaterial.
- Positivt PCR-svar visar förekomst av nukleinsyra — inte nödvändigtvis levande, replikerande virus.
Fallgropar
- Falskt negativt: dåligt taget prov (för ytligt nasofarynxprov), fel tidpunkt i förloppet, RNA-degradering (RNaser är extremt stabila), transporthinder.
- Falskt positivt: amplikonkontamination i laboratoriet — därför separata rum för preparation, amplifiering och analys samt uracil-N-glykosylas som förstör tidigare amplikon.
- Hämmare i provet (hemoglobin, heparin, galla) kan blockera polymeraset — upptäcks av den interna kontrollen.
- Mutationer i primerbindningsstället (nya virusvarianter) kan ge target failure — därför riktas moderna tester mot minst två gener.
Klinisk användning
- Diagnostik av SARS-CoV-2, Influensavirus, RS-virus, Norovirus, Enterovirus, Hepatit C-virus.
- Kvantifiering av virusmängd vid HIV (viral load, mål < 20 kopior/mL under behandling) och hepatit C.
- Minimal residual disease vid leukemi — påvisning av fusionstranskript som BCR-ABL1.
- Genuttrycksanalys i forskning och tumörpaneler.
Klinisk pärla
Ct-värdet ska tolkas med försiktighet som mått på smittsamhet. Efter genomgången COVID-19 kan RNA påvisas i veckor utan att patienten är smittsam — virus kan då inte odlas fram trots positiv PCR. Klinik och tid från symtomdebut avgör.
Tenta-fokus
Kom ihåg varför revers transkriptas behövs: DNA-polymeras kan inte läsa RNA-mall. Alla RNA-virus (inklusive HIV och SARS-CoV-2) kräver därför RT-PCR, medan DNA-virus som Herpes simplex-virus och Cytomegalovirus påvisas med vanlig PCR.
Kopplingar
- PCR — grundmetoden som RT-PCR bygger vidare på
- Revers transkriptas — enzymet från retrovirus som möjliggör steget
- SARS-CoV-2 — den viktigaste kliniska tillämpningen under pandemin
- HIV — kvantifiering av viral load styr behandlingen
- Serologi — komplementär metod som påvisar immunsvar i stället för agens