03 Blodcellsutveckling och B-celler

Blodcellsutveckling i Benmärgen och B-celler i Perifert Blod

Kurs: MDBI Del: 03 Klinisk Kemi

Målsättning

• Redogöra för grundläggande terminologi för enkla hematologiska klinisk-kemiska analyser.
• Redogöra för indikation för beställning av blodstatus.
• Självständigt kunna bedöma analysresultat av blodstatus och B-celler (blodceller).
• Identifiera normala B-celler samt normal erytrocyt- och trombocytbild i mikroskopet på utstryk från perifert blod.
• Känna till principen för benmärgsprovtagning och indikation för bedömning av benmärg.

Avsnittet beskriver normalförloppet hos den friska människan och förbereder för hematologiundervisningen om infektionsförsvar, anemi och leukemi.

Definition

“B-celler” i denna kurs betyder blodceller (B- = provmaterialet blod), inte B-lymfocyter. Terminologin är genomgående prefixbaserad: B- = helblod, P- = plasma, S- = serum.

Stamcellskoncept och cytokiner

• Benmärgens storlek: den blodbildande benmärgen utgör ca 4,5 % av kroppsvikten och producerar dagligen ca 300 miljarder röda och vita blodkroppar.
• Hematopoetisk mikromiljö (HM): krävs för celldelning och utmognad. Utgörs av ett mikrovaskulärt nätverk och adherenta makrofagliknande celler som ingår i stromat i benmärg och mjälte.
• Pluripotent/multipotent stamcell: blodcellernas ursprungscell, har självregenerationsförmåga.
  • Påvisades först hos möss: letalt bestrålade möss transfunderades med benmärgssuspension från friska tvillingmöss. Efter ca tio dagar sågs ny blodbildning i mjälten — CFU-S (colony forming units spleen), där varje koloni var sammansatt av flera celltyper och utgjorde en klon. Detta bevisade att pluripotenta stamceller existerar.
• Unipotenta stamceller: mer mogna stamceller som uttrycker bara ett differentieringsprogram. Uppkommer genom kontinuerligt tilltagande begränsning av den pluripotenta stamcellens differentieringsförmåga: multi → bi → unipotenta stamceller.
• Riktning av differentieringen: vilken poes som slutligen uppstår avgörs av de tillväxtfaktorreceptorer cellen exponerar på sin yta.
• Kliniskt: skörd av stamceller ur blod och benmärg inför benmärgstransplantation i syfte att bota leukemi och myelom.

Utvecklingsträdet — från stamcell till mogen cell

Hematopoesen förgrenar sig i två huvudlinjer från den multipotenta hematopoetiska stamcellen:

Linje	Progenitor	Slutprodukter i perifert blod
Lymfoid	Lymfoid progenitor	B-lymfocyter, T-lymfocyter, NK-celler
Myeloid	Myeloid progenitor	Neutrofila granulocyter, Eosinofila granulocyter, Basofila granulocyter, Monocyter/Makrofager, Erytrocyter, Trombocyter

Den hematopoetiska stamcellen ligger i benmärgshålan intill stromaceller, osteoblaster och adipocyter; en separat stromal stamcell ger upphov till osteoblaster/osteocyter, brosk, benmärgsfett och stödjande stroma.

Myeloida grenens mognadssekvenser:

• Granulopoes: myeloblast → promyelocyt → myelocyt → metamyelocyt → stavkärnig (band) → segmentkärnig mogen granulocyt (neutrofil/eosinofil/basofil).
• Monopoes: myeloblast → promonocyt → omogen monocyt → mogen monocyt → makrofag i vävnad.
• Erytropoes: pronormoblast → basofil normoblast → polykromatisk normoblast → ortokromatisk normoblast → polykromatisk erytrocyt (retikulocyt) → mogen erytrocyt.
• Megakaryopoes: megakaryoblast → promegakaryocyt → megakaryocyt → trombocyter.
• Lymfopoes: lymfoid stamcell → lymfoid progenitor → lymfocyt (B, T, NK).

Cytokiner och tillväxtfaktorer

• Cytokiner: tillväxtfaktorer av peptidnatur som styr blodbildningen. Agerar som tillväxt- och överlevnadsfaktorer och förbättrar även funktionen hos redan mogna granulocyter.
• Colony stimulating factors (CSF): samlingsnamn för cytokiner som reglerar blodcellsbildning. Flera biokemiskt olika CSF med olika specificitet för vilka stamceller de stimulerar till proliferation och differentiering. De flesta är idag renframställda och är alla glykoproteiner med varierande kolhydratkedjor.
• Stamcellsfaktor (SCF): tillväxtfaktor från stromaceller; uttrycks på pluripotenta och unipotenta stamceller.
• Erytropoetin (EPO): hormon från njuren. Renframställt och ges till vissa patienter med anemi, exempelvis anemi sekundär till njurinsufficiens.
• G-CSF / GM-CSF: ges rekombinant för att förkorta aplasiperioden efter benmärgstransplantation och vid behandling av kroniska neutropenier.
  • Verkar inte bara på stamceller utan påverkar även mogna leukocyters aktivitet och metabolism — lokal CSF-produktion i ett inflammatoriskt fokus kan därför stimulera leukocyterna på platsen till optimal funktion.

Klinisk pärla

Erytropoetin vid njursvikt och G-CSF vid neutropeni är de två cytokiner du oftast möter kliniskt — båda är exempel på att man farmakologiskt kan “styra” en enskild poes.

Migration från benmärg till perifert blod

• Mekanismerna är fortfarande delvis oklara.
• In vitro-studier visar att flera faktorer avgör membranpassage av granulocyter.
• I benmärgen avgörs utsläppet av:
  • pordiametern i sinusoidväggen
  • cellens morfologiska ålder
  • cellens förmåga att svara på halten kemotaktiska ämnen

Blodcellutvecklingen i benmärgen

• Barn upp till ca 5 års ålder: röd (aktiv) märg i alla ben.
• Vuxna: ungefär hälften röd aktiv märg, hälften gul fettmärg.
• Kvantitet hos vuxen: ca 0,6 g märg per 1,0 g blod; märgen utgör 3,4–5,9 % av kroppsvikten (1,6–3,7 kg) — motsvarar ungefär leverns vikt.
• Lokalisation hos vuxna: platta och spongiösa ben — revben, bäckenben, kotor, kalott och bröstben.
• Provtagningsställe: vid benmärgsprovtagning punkteras i allmänhet crista iliaca (bäckenbenet).
• Utensilier: aspirationsspruta, petriskål, provrör och utstryksglas.

Indikation för benmärgsprovtagning

• Anemiutredning
• Utredning av andra hematologiska avvikelser
• Behandlingskontroll av hematologiska sjukdomar
• Malignitetsutredning, stadieindelning, diagnos
• M-komponent
• Feberutredning, infektionsutredning
• Hypercalcemiutredning

Bedömning av benmärg

• Vid varje punktion studeras endast en obetydlig del av hela benmärgen, vilken dock i allmänhet ger en representativ bild av hela märgen.
• Felkälla: vid lokala maligna benmärgsförändringar (tumörceller, myelomceller) kan en enstaka punktion bli missvisande om man ej lyckas punktera den misstänkta härden.
• Preanalytiskt: benmärgen är trögflytande och mycket lättkoagulerad. Vid punktion uppkommer alltid en viss blodtillblandning som kan påverka resultatet och ge bilden av en cellfattig märg.
  • Benmärgsutstryk görs därför varligt och omedelbart i anslutning till punktionen.
  • Samtidigt uppsamlas märgpartiklar till en kula som “snittas” för PAD.
• Vid leukemiutredning tas dessutom prov för kromosomanalys och benmärg för flödescytometri (FACS-analys) och fenotypning.
  • Fenotypning = bestämning av cellernas ytmarkörer; underlättar findiagnostik av olika leukemityper eftersom morfologiska särdrag kan vara svårbedömda.

Tenta-fokus

Vid hög blodtillblandning av märgpartiklarna blir fetthalten missvisande låg samt monocyt- och lymfocythalten missvisande hög. Detta är den klassiska preanalytiska fällan vid benmärgsbedömning.

Vid granskning av utstryket bedöms rutinmässigt:

• Cellhalten: cellrik – cellfattig (bedöms i översiktsförstoring, ca 100x).
• Megakaryocyternas antal uppskattas, och i direkt anslutning studeras deras morfologi med immersionslins (1000x förstoring).
• Ev. närvaro av “märgfrämmande” celler (cancerceller) noteras.

Megakaryopoes och megakaryocyt

• På ett normalt benmärgsutstryk är den största cellen en megakaryocyt.
• Inne i benmärgen sitter megakaryocyten nära den sinusoida membranen.
• Megakaryocyter är polyploida celler. För varje mognadsgrad från megakaryoblast → promegakaryocyt → megakaryocyt fördubblas cellens DNA-halt, motsvarande 2, 4, 8, 16, 32 och ibland 64 kromosompar.
  • Ploidi betecknas med N (nuclear number).
  • 2N och 4N motsvarar megakaryocytstamcellen.
  • Vid 32N ses en loberad megakaryocytkärna med riklig trombocytbildning.
• Morfologi (1000x): mycket stor cell, flerloberad/grovt loberad mörkt violett kärna som ofta ser ut som en sammanhängande “klump” av kärnlober, riklig svagt granulerad cytoplasma.
• En fullmogen megakaryocyt som lämnat ifrån sig all cytoplasma har producerat ca 2000–4000 trombocyter.
• Mognadsstörningar som bedöms: hypersegmentering, hypolobering, dålig trombocytbildning.

Erytropoes

• Vid bedömning uppskattas dels mognadskvoten omogen/mogen pool, dels om erytropoesen är normoblastisk eller megaloblastisk.
• Morfologi: erytroblaster har rund, mörk, tät kärna med grovklumpig (“hjulekrar”-liknande) kromatinstruktur och sparsam cytoplasma.
  • Basofil normoblast: stor cell, djupt blå cytoplasma, fin kromatinstruktur.
  • Polykromatisk normoblast: gråblå-till-lilaaktig cytoplasma (blandning av blå RNA och rosa hemoglobin), tätare, mer grovklumpig kärnkromatin, mindre cellstorlek.
  • Ortokromatisk normoblast: rosa (hemoglobinfärgad) cytoplasma och liten, helt tät, pyknotisk mörk kärna som är på väg att stötas ut.

Granulopoes

• Uppskattning av de olika granulocytära och monocytära cellernas antal.
• Ev. mognadsstörningar bedöms: hypersegmentering hos granulocyter, jätteformer av metamyelocyter och stavkärniga granulocyter m.m.
• Morfologi i mognadsordning:
  • Myeloblast: medelstor–stor cell, stor rund kärna med fin, jämn kromatin och tydliga nukleoler, smal basofil (blå) cytoplasma utan granula.
  • Promyelocyt: större cell, kärna fortfarande rund/oval med nukleol, kraftigt basofil cytoplasma med grova azurofila (primära) granula.
  • Myelocyt: rund–oval kärna utan nukleol, tätare kromatin, cytoplasman ljusnar och innehåller sekundära (specifika) granula — cellen blir här identifierbar som neutrofil, eosinofil eller basofil.
  • Metamyelocyt: njurformad/indragen kärna, grovklumpig kromatin, ljus cytoplasma med fina granula. Delar sig ej längre.
  • Stavkärnig: kärnan är ett jämnbrett band/hästsko utan segmentering.
  • Segmentkärnig: kärnan uppdelad i tydliga segment förbundna med tunna trådar.

Lymfopoes och plasmaceller

• Uppskattning av antalet lymfocyter samt bedömning av deras morfologi.
• Normalt ökar antalet lymfocyter med stigande ålder.
• Plasmaceller: antalet bedöms samt granskning av utseendet, t.ex. nukleolförande plasmaceller.
  • Morfologi: excentriskt placerad kärna med “hjulekerkromatin”, djupt basofil cytoplasma och perinukleär uppklarning (Golgi-zon).

Retikelceller och fixa RES-celler

• Retikelceller granskas samt ev. cellförband (ev. tecken på annan malignitet) noteras.
• I punktatet kan ibland iakttas celler som egentligen räknas till de fixa RES-cellerna:
  • Osteoblaster
  • Osteoklaster
  • Fibroblaster
  • Fibrocyter
  • Vävnadsbasofila (mastceller)

E/G-kvot och mognadskvot

G-kvot = förhållandet mellan erytropoes (E) och granulopoes (G) i benmärgen.

Tenta-fokus

Mogna erytrocyter räknas INTE med i kvoten — endast kärnförande erytroblaster inkluderas på E-sidan. På G-sidan räknas både omogna och mogna granulocyter med. Normal E/G-kvot ≈ 1/3. Mognadskvot: E ca 1/4 och G ca 1/4 (omogen/mogen pool).

Ungefärlig cellfördelning i normal benmärg (från omogen till mogen inom varje poes):

Cellgrupp	Ingående celler	Andel
Granulopoes (G)	myeloblaster, promyelocyter, myelocyter, metamyelocyter, stavkärniga, segmentkärniga	Dominerar utstryket; störst andel utgörs av segmentkärniga och stavkärniga
Monopoes	promonocyter–monocyter	Litet band
Erytropoes (E)	pronormoblaster, basofila normoblaster, polykromatiska normoblaster, ortokromatiska normoblaster	Ca 1/3 av granulopoesen; polykromatiska normoblaster är den största enskilda gruppen
Lymfocyter	mogna lymfocyter	Litet men tydligt band
Övriga	plasmaceller, megakaryocyter, retikelceller	Endast enstaka celler

Klinisk pärla

En kraftigt förskjuten E/G-kvot är i sig en diagnostisk ledtråd: ökad E (låg kvot-nämnare, dvs. E/G stiger) talar för hemolys eller blödning med reaktiv erytropoes; minskad E talar för aplasi eller ren erytrocytaplasi.

Erytrocyter i perifert blod

• Form: normalt en bikonkav disk.
• Diameter: ca 7–8 µm — ungefär jämförbar med en liten lymfocytkärna (praktisk måttstock i mikroskopet).
• Färgning: i mitten av erytrocyten ses ca 1/3 uppklarning, vilket motsvarar normal hemoglobinhalt. Ökad central uppklarning = hypokromi.
• Membran: ett bipolärt lipidlager som innehåller strukturupprätthållande och kontraktila proteiner samt ett stort antal enzymer och ytantigener.
• Cytoskelettkomplexet innanför membranen utgörs huvudsakligen av fyra interagerande proteiner:
  • Spektrin
  • Aktin
  • Protein 4.1
  • Ankyrin
• Cytoskelettet ansvarar för att bibehålla erytrocytens normala form. Brist på eller defekter i något av dessa proteiner ger formförändringar och abnorm cellmembranrigiditet.
  • Elliptocytos och Sfärocytos härleds från olika defekter hos cytoskelettproteinerna.
  • Förändringar i lipidsammansättningen ger andra membranförändringar: ökning av fosfolipid + kolesterol ger target celler; ökning av enbart kolesterol kan ge akantocyter.
• Morfologiskt abnorma erytrocyter kan ha förkortad livslängd p.g.a. ökad hemolys.

Storleks- och formförändringar hos erytrocyten

Förändring	Beskrivning	Ses bl.a. vid
Makrocyter	> 9 µm	retikulocytos, leversjukdom, B12-brist/Folatbrist
Mikrocyter	< 6,5 µm	järnbristanemi, kongenital hemolytisk anemi, thalassemi
Anisocytos	Uttalad storleksvariation	Anemifynd, ofta tillsammans med poikilocytos
Poikilocyter	”Olikformade” celler	megaloblastanemi, myelofibras med myeloid metaplasi
Schistocyter	Mekaniskt fragmenterade erytrocyter, variant helmet cells	disseminerad intravasal koagulation, vitium med klaffprotes, grav arterioskleros, uremi
Targetceller	”Måltavleceller” — hemoglobinet samlat i mitten och i periferin, med mellanliggande ljuszon	thalassemi, efter splenektomi, svår järnbrist, leversjukdom
Sfärocyter	Små sfäriska erytrocyter utan central uppklarning	Hereditär sfärocytos, hemolytiska anemier, efter blodtransfusion
Ovalocyter	”Elliptocytos” — ovala celler	< 15 % anses normalt. Hereditär elliptocytos med 90–100 % ovala erytrocyter
Sickleceller	”Drepanocyter” — skärformade	Sicklecellanemi, Hb S-S (Hb S i reducerat tillstånd ger “sickling”)
Megalocyter	”Jättestora, ovala”, ofta tillsammans med mikrocyter	Megaloblastanemi
Akantocyter	Liknar “spikklubborna” (artefakt-liknande taggiga utskott)	hereditär abetalipoproteinemi, leversjukdom från cirros, njursjukdom
Stomatocyter	Stoma = mun; springformad central uppklarning	alkoholism med eller utan leversjukdom, Hereditär stomatocytos

Tenta-fokus

Håll isär gränserna: makrocyt > 9 µm, mikrocyt < 6,5 µm, normal erytrocyt 7–8 µm. Och håll isär sfärocyt (rund, saknar central uppklarning, hereditär sfärocytos/AIHA) från targetcell (extra hemoglobin i centrum, thalassemi/leversjukdom) — de förväxlas ofta.

Trombocyter

• I blodet cirkulerar trombocyter som skivor (diskar).
• Vid aggregation blir de sfäriska, skickar ut pseudopodier och adhererar till varandra.
• Morfologi i utstryk: liten, kärnlös, blekt blågrå cellpartikel med fina purpurröda (azurofila) granula; storleken är ca 10 gånger mindre än en normal erytrocyt.

Neutrofila granulocyter

• Cirkulerar under normala förhållanden ett par dagar i blodet och dör genom apoptos.
• Vid akut inflammation rekryteras neutrofila granulocyter från blodcirkulationen till inflammationsfokus.
  • Cellmembranen är försedd med speciella bindningsställen, s.k. Integriner, som binder till endotelcellers bindningsställen.
  • Detta sker i olika steg och slutar med att granulocyterna kommer ut i vävnaden där de deltar i elimination av mikroorganismer.
• Innehåll: ett stort urval nedbrytningsenzymer (proteaser) och baktericida proteiner i både primära granula (membranbundna lysosomer) och sekundära granula.
• Antiproteaser behövs som regulatorisk mekanism eftersom proteaserna är mycket potenta och ingår i både den inflammatoriska processen och läkningsprocessen. Hit hör:
  • Alfa-1-antitrypsin — hämmar framför allt serinproteaser, i synnerhet neutrofil elastas
  • Alfa-2-makroglobulin
  • andra akutfasproteiner, vars syntes ökar i levern vid inflammation
• Morfologi: kärnan segmenterad, normalt 3–5 segment förbundna med tunna kromatintrådar; grovklumpig, mörkviolett kromatin. Cytoplasman är svagt rosa/neutral och uppvisar främst små rosa granula.

Klinisk pärla

Medfödd brist på alfa-1-antitrypsin leder till oreglerad neutrofil elastasaktivitet och därmed svåra vävnadsskador med efterföljande fibrosutveckling, framför allt i lunga och vävnad. Detta är den mekanistiska förklaringen till tidigt emfysem hos unga icke-rökare.

Monocyter och makrofager

• Blodmonocyten utvecklas till makrofag med möjlighet till vidare mitotisering i vävnaderna.
• Monocyter/makrofager är lysozymrika celler. Tillsammans med neutrofila granulocyter utgör de ett mycket effektivt fagocytossystem mot mikroorganismer. Liksom neutrofila granulocyter innehåller även monocyter/makrofager lysozym.
• Samspel med lymfocyter under immunsvar:
  • Makrofagen presenterar antigen för T-lymfocyterna.
  • Lymfocytaktiveringen främjar i sin tur monocytens/makrofagens fagocytosförmåga.
  • Monocyter/makrofager producerar cytokiner, bl.a. IL-1 och IL-6, vilka stimulerar lymfocytproliferation och differentiering.
  • Efter transformation produceras tillväxtfaktorn IL-2 av lymfocyterna. IL-2 stimulerar T-celler till mitos, ger en aktiverande signal till NK- och B-celler samt stimulerar regulatoriska T-celler att stänga av immunsvaret när en infektion är eliminerad.
• Makrofagen utgör därmed en länk mellan det myelopoetiska och det lymfatiska systemet.
• Morfologi: stor cell; kärnan är grovmaskig och loberad (ofta njur- eller hästskoformad, veckad). Riklig cytoplasmamängd, ofta grå-blå och översållad med små rosa granula; ibland med vakuoler.

Eosinofila granulocyter

• Till skillnad från neutrofila granulocyter har eosinofila granulocyter granula med kristalliknande struktur.
• Rika på peroxidas och synnerligen rika på ett extremt alkaliskt protein, major basic protein (MBP), vars huvudsakliga funktion visats vara förmågan att binda till membran av parasiter och därigenom förstöra membranen.
• Andra proteiner i dessa granula:
  • eosinofil peroxidas, EPO
  • eosinofil derived neurotoxin, EDN
  • eosinofil cationic protein, ECP — kapabel att binda och neutralisera heparin. ECP frigörs från aktiverade eosinofila granulocyter och kan mätas i patientens blod som mått på den inflammatoriska komponenten i sjukdomen.
• Förutom de specifika granula innehåller eosinofila granulocyter mindre granula med arylsulfatas och sur fosfatas.
• Interaktion med mastceller: eosinofila granulocyter frigör histaminas och arylsulfatas, vilket inaktiverar histamin och “slow reacting substance of anaphylaxis” från mastceller — dvs. eosinofilen dämpar den allergiska reaktionen.
• Mobilitet: samma som neutrofila granulocyter, men till skillnad från dessa har eosinofila granulocyter IgE-receptorer.
• Cirkulationstid: ca tre timmar i blodet; återfinns därefter framför allt i huden, lungorna och gastrointestinala trakten.
• Morfologi: oftast 2 kärnlober (“glasögonkärna”). Granula är laxfärgade (kraftigt orange-röda) och större än i den neutrofila granulocyten, och fyller hela cytoplasman.

Basofila granulocyter och mastceller

• Basofila granulocyter är bildare och bärare av histamin och heparin.
• Nästan all histamin i blodet härrör från basofila granulocyter, medan vävnadsbasofila, s.k. mastceller, står för förrådet av histamin i vävnaderna.
• De har Fc-receptor för IgE och frisläpper histamin och heparin vid stimulering med komplex av allergen och IgE-antikropp.
• Frisläppt histamin orsakar vasodilatation och utökad permeabilitet av blodkärl.
• Utsläpp av aktiva substanser från basofila granulocyter/mastceller kan hämmas av eosinofila granulocyter.
• Morfologi: stora blå-svarta granula som ofta täcker hela cellen. Kärnan syns ofta dåligt men brukar vara stav- eller segmentkärnig. Cytoplasmabakgrunden är intensivt rosa.

Tenta-fokus

Klassisk förväxling: basofil (mörkt blå-svarta granula som skymmer kärnan) vs eosinofil (laxfärgade/orangeröda granula, tvålobig kärna som syns tydligt). Kom också ihåg eosinofilens IgE-receptor och att den motverkar mastcellsmedierad allergi via histaminas och arylsulfatas.

Lymfocyter i perifert blod

I normalt perifert blod ses vanligen en blandning av lymfocyter:

Typ	Andel	Morfologi	Funktion
B-lymfocyter	Minoritet	Små, cytoplasmafattiga; liten rund mörk kärna med tät, grovklumpig kromatin och endast en smal blå cytoplasmabräm	Vid immunsvar utvecklas B-lymfocyter till plasmaceller som bildar antikroppar (humoralt försvar)
T-lymfocyter	Ca 75 % av lymfocyterna i normalt perifert blod	Lite större, med rikligt ljusblå cytoplasma; kärnan rund–lätt oval	Utgör det cellulära försvaret
Stora granulära lymfocyter (NK-celler)	Enstaka	Stora, rikligt ljus cytoplasma med tydliga azurofila granula, excentrisk njurformad kärna	Troligtvis natural killer-celler

Klinisk pärla

Storleksreferensen i utstryket: en liten lymfocytkärna ≈ en normal erytrocyt (7–8 µm). Använd den som intern måttstock för att bedöma anisocytos, mikro- och makrocytos utan mätverktyg.